在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發時，在波長為350nm光的激發下發出450nm熒光；而在雙光子激發時，可采用750nm的激發光得到450nm熒光。由于雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。雙光子顯微鏡在多個領域研究中已有許多成功實例。國內激光雙光子顯微鏡光毒性

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優點：☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區域內可以激發出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內；☆漂白區域小：由于激發只存在于交點處，所以焦點以外的區域都不會發生光漂白現象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高。熒光雙光子顯微鏡光毒性雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?

與普通顯微鏡相比，電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物，冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子。雙光子顯微鏡有什么優勢？它能做普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來雙光子顯微鏡可以準確穿透厚標本進行定點和***觀察！因為電磁波的波長越短，粒子越強，散射的影響越大。雙光子顯微鏡將激發光源改為長波長激光，增加了激光的穿透力，同時降低了對細胞的毒性。此外，由于雙光子激發效應只能發生在物鏡的焦點處，因此掃描精度極高，還可以提高激發光效率，減少掃描點以外的熒光物質的消耗。

雙光子技術在醫學診斷方面有著巨大的應用潛力。這方面沒有標準和體系，需要系統的醫學研究和龐大的醫學數據支撐。通過基于多光子成像技術研究細胞結構、生化成分、微環境、組織形態、代謝功能的影響信息，可以發現與細胞學、分子生物學、組織病理學、疾病的診斷和特征的關系。共同探索生理病理基礎和分子細胞生物學機制，篩選皮膚病、自身免疫性疾病等疑難疾病的識別、診斷和鑒別診斷依據，建立全新完整的多光子細胞診斷數據庫，明確不同疾病的多光子臨床檢測設備產品標準。在討論環節，來自病理科、呼吸中心、心內科、神經內科、皮膚科、研究所的多位醫生和科研人員結合各自的工作領域，與王愛民副教授進行了熱烈的討論。其中，毛發中心楊頂權主任擬再次邀請王愛民副教授進行學術交流。通過此次學術交流，病理學系和研究所分別與王愛民副教授課題組達成了初步合作意向。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像。

雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因為激光而得到實驗驗證，但WinfriedDenk用了近30年才發明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生的非線性過程，需要極高的電場強度，電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只有激光脈沖寬度。基于以上分析，能夠輸出高重復率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經成為雙光子顯微鏡的標準激發光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優勢:雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光強較低，無法激發，所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物。美國雙光子顯微鏡應用

雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗；國內激光雙光子顯微鏡光毒性

隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本的“透明度”得到提高。國內激光雙光子顯微鏡光毒性