雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術的一種新技術。雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發體積小，具有定點激發的特性，具有更少的光毒性；激發波長由紫外、可見光調整為紅外激發，能夠更加地安全。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的；國內雙光子顯微鏡的原理

從雙光子到三光子：科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。美國investigator雙光子顯微鏡分辨率雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例。

要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達到最大值所持續的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發的高光子密度要求，又能不損傷細胞，使掃描能更好地進行。

隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本的“透明度”提高。雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源。

使用雙光子顯微鏡可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經元活動，但神經元活動的速度對于常規的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。雙光子顯微鏡有哪些應用呢？2PPLUS雙光子顯微鏡商家

雙光子顯微鏡能夠進行光裂解、光轉染和光損傷等光學操縱。國內雙光子顯微鏡的原理

雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因為激光而得到實驗驗證，但WinfriedDenk用了近30年才發明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生的非線性過程，需要極高的電場強度，電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只有激光脈沖寬度。基于以上分析，能夠輸出高重復率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經成為雙光子顯微鏡的標準激發光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優勢:雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光強較低，無法激發，所以雙光子成像更清晰。國內雙光子顯微鏡的原理