與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個優(yōu)勢極大地促進(jìn)了研究者們對于完整在體大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題，但這會帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。神經(jīng)方面科學(xué)迫切需要一種能夠兼顧全局和微觀的新型鈣成像技術(shù)。深圳神經(jīng)元鈣成像參考價

可見光激發(fā)Ca2+熒光探針與紫外光激發(fā)探針相比，可見光激發(fā)Ca2+探針具有更強(qiáng)的染料吸收性能，對Ca2+變化水平檢測敏感度也更高，能夠降低對活細(xì)胞的光毒性和樣品自發(fā)熒光以及光散射的干擾，且無光譜偏移。常使用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針有Fluo-3，F(xiàn)luo-4，Rhod-2等，同時他們也都是非比率型指示劑。Fluo-3是常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光指示劑之一，是典型的的單波長指示劑，比較大激發(fā)波長為506nm，比較大發(fā)射波長為526nm。它與Ca2+結(jié)合之前幾乎無熒光，結(jié)合后熒光會增加60至100倍，從而避免了細(xì)胞自身的熒光干擾。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右，發(fā)射波長為525～530nm。Fluo-3可以用在激光共聚焦顯微成像或流式細(xì)胞儀中。它還有一個升級版本Fluo-4，在相同Ca2+濃度下信號更強(qiáng)。合肥熒光顯微鈣成像參考價功能性多神經(jīng)元鈣成像是一種通過記錄神經(jīng)元內(nèi)Ca2+信號變化,監(jiān)測大量神經(jīng)元動作電位的光學(xué)記錄技術(shù)。

哥倫比亞大學(xué)ZuckermanMind大腦行為研究所的RuiM.Costa課題組于2020年10月7日在Cell雜志上發(fā)表了一篇題為AnAmygdalaCircuitMediatesExperience-DependentMomentaryArrestsduringExploration的文章，作者開發(fā)一種用于研究小鼠探索活動中瞬時停滯行為機(jī)制的新型實驗，通過行為分析、環(huán)路映射、滔博生物-Inscopix自由活動鈣成像顯微鏡結(jié)合光遺傳學(xué)手段，提供介導(dǎo)經(jīng)驗依賴性的瞬時停滯行為的BLA神經(jīng)元群體的jihuo和投射證據(jù)，表明BLA-CEA環(huán)路可以作為新穎/熟悉情境的檢測器和效應(yīng)器，用于基于空間位置的熟悉程度來生成自定進(jìn)度的行為停滯，這一響應(yīng)對于動物對未知環(huán)境進(jìn)行安全有效的探索是至關(guān)重要的。

單光子顯微技術(shù)是較成熟的熒光顯微技術(shù)，但由于其使用的激發(fā)光波長較短，成像深度有限；能量較大,會造成對熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現(xiàn)樣本三維成像要逐點(diǎn)掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細(xì)胞成像。而寬場顯微鏡能夠很好地實現(xiàn)實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實時檢測，但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現(xiàn)多維成像。Derrick想重點(diǎn)介紹一下較為常用的觀察設(shè)備——雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長波激發(fā)，能對組織進(jìn)行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對這個波段的光吸收率低，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個樹突棘中的鈣分布。通過鈣成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的活動與其內(nèi)部的鈣離子濃度密切相關(guān)。

傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡由于光散射的影響，只能夠?qū)Υ竽X淺層的神經(jīng)元或在離體組織上進(jìn)行成像，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大，一般也只用于離體鈣成像。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展，在體鈣成像技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展。雙光子熒光顯微鏡能夠在進(jìn)行活動動物成像的時候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比。例如，用雙光子顯微鏡對海馬樹突棘的鈣離子信號進(jìn)行成像，研究神經(jīng)元突觸后長時程yizhi(Wangetal.,2000)；觀察活動小鼠運(yùn)動皮層神經(jīng)元在嗅覺選擇任務(wù)中刺激相關(guān)電位(Komiyamaetal.,2010)等等。不過，這些實驗還是需要對動物進(jìn)行麻醉和固定，而神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域很多研究更希望能夠?qū)ψ杂苫顒拥膭游镞M(jìn)行研究。鈣成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用于同時監(jiān)測成百上千個神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化。北京熒光顯微鈣成像參考價

進(jìn)行鈣測定必須借助外界的某種可視化物質(zhì)作為它的標(biāo)志物。深圳神經(jīng)元鈣成像參考價

在生物有機(jī)體，鈣離子產(chǎn)生各種各樣的胞內(nèi)信號，這些胞內(nèi)信號幾乎在每種類型的細(xì)胞中都存在，且在很多功能方面有重要作用，例如對心肌細(xì)胞收縮的控制和從細(xì)胞增殖到細(xì)胞死亡整個細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等。在哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子是一類重要的神經(jīng)元胞內(nèi)信號分子。在靜息狀態(tài)下，大部分神經(jīng)元的胞內(nèi)鈣離子濃度為50-100nM，而當(dāng)神經(jīng)元活動的時候，胞內(nèi)鈣離子濃度能上升10-100倍，增加的鈣離子對于包含有神經(jīng)遞質(zhì)的突觸囊泡的胞吐釋放過程必不可少。也就是說神經(jīng)元的活動與其內(nèi)部的鈣離子濃度密切相關(guān)，神經(jīng)元在放電的時候會爆發(fā)出一個短暫的鈣離子濃度高峰。神經(jīng)元鈣成像（calciumimaging）技術(shù)的原理就是借助鈣離子濃度與神經(jīng)元活動之間的嚴(yán)格對應(yīng)關(guān)系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針(鈣離子指示劑，calciumindicator)，將神經(jīng)元當(dāng)中的鈣離子濃度通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，從而達(dá)到檢測神經(jīng)元活動的目的。深圳神經(jīng)元鈣成像參考價